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INTRODUCCIÓN

El uso de biguanidas para el tratamiento farmacológico y el control de la diabetes mellitus tipo 2 en niños y adolescentes es una de las estrategias que se llevan a cabo en endocrinología pediátrica en nuestra institución, debido al aumento de casos en los últimos diez años de esta condición que antes afectaba sólo a los adultos.¹ La quercetina es un compuesto de origen vegetal que tiene propiedades antidiabéticas parecidas a la metformina,² y está presente en alimentos muy comunes. Por lo tanto, nosotros suponemos que los pacientes que toman metformina podrían necesitar menor dosis de este medicamento para el control de su diabetes si incluyeran en su dieta mayor cantidad de alimentos con altas concentraciones de quercetina, como la cebolla, manzana, arándano, espinaca y cilantro. El presente es un primer acercamiento in vitro que pone en evidencia el empleo seguro de quercetina en un sistema de células humanas en cultivo, a una concentración con la que se logra la entrada de glucosa a las células.

La quercetina es un nutrimento

La quercetina (QT), 2-(3,4-Dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-1-benzopirano-4-1 dihidrato, 3,3′,4′,5,7-pentahidroxiflavona dihidrato es un compuesto de origen vegetal (flavonoide), presente en una gran cantidad de frutos y plantas comestibles.³ Se ha recomendado como complemento alimenticio natural para ayudar a bajar de peso y controlar la glucosa en pacientes con diabetes mellitus tipo 2, por su efecto como inhibidor competitivo en la actividad de los transportadores de glucosa en la célula.^4-7 Esta inhibición puede ser tan rápida que su efecto se ve reflejado en la disminución de la glucosa postprandial.⁷ Además, la quercetina también es transportada por la misma proteína que transporta la glucosa desde el intestino hacia la sangre, que es el transportador GLUT1. Es por esto que la QT inhibe el transporte de glucosa desde los alimentos.⁸

La QT es abundante en la cebolla, cilantro, kiwi, apio y en la moringa.⁹ Esta última, es una planta que contiene hasta 100 mg de QT por cada 100 g en sus hojas,^10,6 y su consumo se ha incluido recientemente en la dieta de muchas poblaciones en todo el mundo, y ha mejorado la calidad de vida y el bienestar en pacientes adultos con diabetes, en forma complementaria a su tratamiento con medicamentos.^6,11 La QT se ha clasificado recientemente como un “nutracéutico”, por sus propiedades nutricionales y farmacéuticas, que son principalmente antioxidantes y antiinflamatorias,¹² y sus efectos benéficos en condiciones neurológicas como el trastorno del espectro autista están comenzando a vislumbrarse en estudios preclínicos.¹³

Demostración de la actividad biológica de la QT

En este trabajo se determinó si la QT promueve el transporte de glucosa al interior de células humanas no cancerosas en cultivo, para lo que se eligieron fibroblastos HA19, de rápida proliferación. Asimismo, se evaluó si la QT contribuye a inhibir el crecimiento y multiplicación de estas células a diferentes concentraciones.

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente trabajo forma parte del protocolo 065/2019, aprobado por los comités de Bioseguridad e Investigación del INP y fue desarrollado con presupuesto federal 2021 y 2022.

Sistema biológico de experimentación

Para estimar el grado de citotoxicidad de la QT y su efecto sobre el transporte de glucosa, se emplearon células humanas no cancerosas en cultivo, que fueron fibroblastos sanos de la línea celular HA19. Estas células se pusieron a proliferar en botellas de cultivo de 75 cm² de superficie, con 15 mL de medio mínimo esencial modificado de Dulbeco (DMEM-F12, de Sigma-Aldrich) enriquecido con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de antibiótico y antimicótico que contiene todos los elementos nutritivos adecuados para el metabolismo de las células que están en proliferación. Las células se incubaron a 37^oC con atmósfera de CO₂ al 5%, y se les cambió el medio cada 48 horas, hasta alcanzar una confluencia de 80 a 100%. Las células se cosecharon incubándolas con 3 mL de una solución de tripsina-EDTA a 37^oC, por 3 minutos. Se les agregaron 7 mL de medio DMEM-F12 y se centrifugaron a 2500 rpm.

Citotoxicidad de la QT

Se determinó la concentración de QT que inhibió el crecimiento y reproducción de las células en cultivo. Después de cosechadas, las células HA19 se sembraron a razón de 5×10⁵ células en placas de 6 pozos con 2 mL de medio de cultivo en cada pozo, y se incubaron con atmosfera de 5% de CO₂ y 95% de aire, durante 24 horas. Se les dio tratamiento con QT a diferentes concentraciones y se incubaron a 37°C por 24 horas. El control de células vivas, fueron células que no recibieron ningún tratamiento. El testigo de muerte celular (MC) consistió en células tratadas con ácido ascórbico 300 mM y sulfato de cobre 30 mM, y se incubaron durante 60 minutos para inducirles muerte por daño oxidativo. Concluida esta incubación, se retiró el medio, se les agregó medio nuevo y se incubaron 24 horas, esto con el fin de evaluar la capacidad proliferativa de las células después de estar expuestas a daño. Los tratamientos consistieron en QT como estándar puro (QTS), como suplemento alimenticio de marca comercial (QTC) y como extracto de moringa en solución acuosa (Mor), a diferentes concentraciones y se incubaron por 24 horas. Se les retiró el medio de cultivo para cuantificar la glucosa y se tomó 1 mL de medio y se le añadieron 100 µL de ácido ascórbico 10 mM, para estabilizar la QT y se almacenó a -80°C hasta su cuantificación. Posteriormente las células se lavaron tres veces con solución salina amortiguada de fosfatos (PBS, “phosphate-buffered saline”) a 37^oC, para retirar los restos de medio de cultivo y de QT. Posteriormente, a cada pozo se le agregó 1mL de una solución de formaldehido 10% amortiguado con PBS pH=7.4, y se dejaron reposar 15 minutos a temperatura ambiente. Se enjuagaron tres veces con PBS. Las células se tiñeron con el colorante violeta de cristal. Se les añadieron 950 µL de PBS y 50 µL de violeta de cristal (0.4g/100 mL de metanol), se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Se enjuagaron tres veces con PBS y se dejaron secar hasta el día siguiente. Se les añadió 1 mL de metanol, se incubaron 10 minutos; se les añadió 1 mL de etanol. Se incubaron 30 minutos. Se midió la absorbancia de los pozos a una longitud de onda de 590 nm en un lector de placas de ELISA (Epoch™, BioTek Instruments).

Los valores de absorbancia de las muestras se transformaron matemáticamente a porcentajes de proliferación, a partir de los testigos. Al control de células sin tratamiento se le asignó el 100% de proliferación, y al testigo de células con daño inducido, se le asignó el 0%.

Transporte celular de glucosa por efecto de QT

Se determinó la concentración de glucosa en el medio de cultivo con el método de glucosa oxidasa, para estimar la cantidad de este monosacárido después de tratar las células con QT. Al control se le asignó un valor de glucosa extracelular de 1, es decir, el valor basal y, de ahí se calcularon los cambios de concentración de glucosa en cada tratamiento y se expresaron como incrementos o decrementos de glucosa extracelular. La técnica enzimática de glucosa oxidasa se validó comparándola con el procedimiento de determinación clínica de glucosa en suero, en el Laboratorio de Química Clínica de nuestra institución.

Presentaciones de QT evaluadas

Para determinar la citotoxicidad de la QT en fibroblastos HA19, y su efecto sobre la glucosa extracelular, así como para la validación del método analítico para cuantificar QT, se empleó el estándar puro de QT (QTS): grado reactivo, Sigma-Aldrich, Lote # SLCC971. Asimismo, se comparó el efecto citotóxico de QT en otras dos presentaciones: quercetina como suplemento alimenticio de marca comercial (QTC), y quercetina en extracto acuoso de moringa (Mor).

La razón por la que se comparó el estándar puro de QT, con las otras dos presentaciones, es debido a que la población suele consumir este flavonoide en vegetales y en suplementos alimenticios que se expenden en tiendas naturistas y en farmacias, por lo que fue necesario demostrar que la QTS, efectivamente, tuvo un efecto distinto que en las cápsulas o en los extractos.

Se pesaron 10 mg de QT estándar en una balanza analítica. Se disolvió en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) y se añadieron 4 mL de metanol. Esta solución se diluyó para obtener las soluciones de trabajo, empleando etanol al 70%. En un lote de células aparte, se colocó un volumen con esta mezcla de disolventes, como testigo, para asegurarnos de que no tuvieran un efecto citotóxico adicional al de la QT. El contenido de las cápsulas comerciales de QT, marca aSquared Nutrition, se disolvió de la misma forma que la QT estándar.

Para la obtención del extracto acuoso de moringa, se pesaron 28 gramos de polvo de las cápsulas de moringa, marca VidaMorin^®, se les añadieron 150 mL de agua bebible. En condiciones asépticas, se dejó hervir por 10 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se centrifugó por 10 minutos, a 12,000 rpm, en un tubo de centrífuga tapado y sellado con Parafilm. Se filtró con membrana de 0.22 µm de tamaño de poro y se almacenó a -80°C, por un período no mayor a 14 días, que fue tiempo en el que la QT mostró ser estable.

Cuantificación de QT en el medio de cultivo

La concentración de QT en el medio de cultivo se determinó por cromatografía líquida de alto desempeño acoplada a detección por absorbancia de luz ultravioleta (HPLC-UV), mediante un método analítico implementado y validado en nuestro laboratorio, con estricto apego a la NOM-177-SSA1-2013¹⁴ y mediante técnicas de extracción y cuantificación ya reportadas.^15,16

RESULTADOS

Inhibición de la proliferación celular

Inhibición de la proliferación de HA19 por QTS

Se determinó la citotoxicidad de QT a diferentes concentraciones, mediante un ensayo de inhibición de la proliferación celular. Los resultados de cada una de las concentraciones evaluadas están expresados como el promedio y la desviación estándar de cuatro réplicas por experimento, y de tres experimentos independientes, es decir, doce resultados por cada concentración de QT. En la Figura 1, Panel A, se muestran los porcentajes de proliferación celular originados por QTS en fibroblastos HA19. El crecimiento y multiplicación de estas células se inhibió en forma proporcional al aumento de concentración de QT. A la concentración de 8.39 µg/mL, se obtuvo una proliferación de sólo el 51.28% de la normal, es decir, comparada con el 100% de proliferación que se obtuvo con el testigo sin tratamiento; de modo que 8.39 µg/mL fue la concentración inhibitoria 50 (IC₅₀). A la concentración de 33.56 µg/mL, la QTS originó que las células proliferaran sólo al 28.2% de lo normal. La proliferación de estos fibroblastos disminuyó a menos del 10% a las concentraciones más altas, ya que fue de sólo 8.4% a la concentración de 101.43 µg/mL y de 6.9 % a la concentración de 167.8 µg/mL. A ninguna concentración de QT evaluada se observó que se promoviera la proliferación celular por encima del testigo sin daño.

Inhibición de la proliferación de HA19 por QTC

La citotoxicidad causada por QT en su presentación de suplemento alimenticio (QTC), se evaluó a concentraciones en un intervalo desde 0.075 hasta 30.23 mg/mL y no se observó que la proliferación celular disminuyera conforme al aumento de la concentración (datos no mostrados). Al contrario, a las concentraciones de 0.075, 0.15, 0.30 y 3.023 mg/mL, originó prácticamente el mismo porcentaje de citotoxicidad, que fue de 34.6, 37.9, 36.9 y 29.5%, es decir, prácticamente el mismo efecto a todas las concentraciones. Por otro lado, las células tratadas con QTC proliferaron a menos del 50%.

Inhibición de la proliferación HA19 por Mor

Con respecto a las células que se expusieron a Mor, a bajas concentraciones (0.56, 2.8 y 5.6 mg/mL) provocó una inhibición de la proliferación celular muy cercana al 50%, pero la proliferación aumentó cuando se evaluó a la concentración de 15 mg/mL, pues originó que las células proliferaran al 93.1%, casi igual que el control. Este comportamiento de las células tratadas con Mor parece indicar que, a bajas concentraciones origina citotoxicidad, pero al aumentar la concentración, podría ser protectora.

Como se ha descrito, la tendencia de la QT para inhibir la proliferación de los fibroblastos HA19, fue muy distinta cuando se administró en extracto acuoso (Mor). Este efecto era de esperarse, ya que los otros compuestos presentes en el extracto acuoso de moringa, podrían contribuir en su efecto protector. Por lo tanto, en estudios posteriores será necesario evaluar concentraciones mucho menores de QTC y de Mor, para lograr determinar la IC50. Para fines del presente estudio, sólo se pudo determinar la concentración inhibitoria 50 de QTS en fibroblastos humanos en cultivo.

Inhibición de la proliferación por QT en sus tres presentaciones

Las células HA19 se expusieron a la misma concentración de QT, 8 µg/mL, por 24 horas. Lo diferente fue la presentación, a fin de evaluar en qué medida los componentes de QTC y Mor, interfieren en la citotoxicidad. La QT en estándar puro, originó 51.17% de proliferación; mientras que las células expuestas a Mor proliferaron 83.6%, es decir, en forma de extracto acuoso, la QT originó mucho menos citotoxicidad (Figura 1, Panel A). Las células se expusieron a QTC disuelta con dos procedimientos diferentes, ya que se observó un precipitado inusual cuando se disolvió siguiendo el protocolo recomendado y se decidió modificarlo para obtener una mejor disolución. De este modo, expusimos las células a QTC, disuelta parcialmente, y QTCp, disuelta y filtrada por procedimiento adicional. QTC originó la muerte de casi todas las células, pues sólo proliferaron el 4.7% (Fig. 1, Panel A); mientras que QTCp indujo una proliferación del 62.77% (Fig. 1, Panel A), lo que sugiere que los componentes del precipitado en este suplemento alimenticio fueron los causantes de la citotoxicidad y no la quercetina.

Glucosa extracelular

Se determinó la concentración de glucosa extracelular, es decir, en el medio de cultivo, para estimar la glucosa que se introdujo a las células por acción de la QT. Este flavonoide originó disminuciones en la concentración extracelular de glucosa, con respecto del control, en todas las presentaciones a concentración de 8 µg/mL (Fig. 1, Panel B). La concentración de glucosa en el medio sin células (432 mg/dL) se consideró como el basal (100%). Los aumentos o disminuciones a este valor, por acción del metabolismo celular o los tratamientos, se expresaron como porcentajes respecto del basal. Los resultados se expresaron finalmente como incrementos o disminuciones en el porcentaje de glucosa basal. En la figura 1, Panel B se observa: QTS disminuyó 17.2% la glucosa extracelular; QTC la disminuyó 14% y QTCp 10.1%. Mor fue el tratamiento que más disminuyó la glucosa extracelular (20.7%). Estos hallazgos sugieren que la QT promovió el transporte de glucosa al interior de las células.

Validez del método analítico para cuantificar QT

El método analítico mostró ser lineal en el rango de concentración de 0.1 a 12 µg/mL con coeficientes de correlación r = 0. 0.9992

La recuperación absoluta se determinó mediante el porcentaje de QT recuperada después del procedimiento de extracción, comparando la concentración de la QT extraído con las mismas concentraciones de QT en solución. La recuperación fue mayor del 96%, para las tres concentraciones problema. El límite de cuantificación para la quercetina fue de 0.04 µg/mL y el límite de detección fue de 0.01 µg/mL.

La quercetina en el medio de cultivo DMEM conteniendo 10mM de ácido ascórbico es estable en refrigeración (4°C) por 7 días, a -80°C hasta por 90 días y se pueden congelar y descongelar hasta seis veces

Cantidad real de quercetina en la presentación de suplemento naturista (QTC) y en extracto de moringa (Mor)

Se determinó la concentración de QT en la forma comercial y en el extracto herbal, mediante un método analítico por HPLC, implementado y validado en nuestro laboratorio Cuadro 1. Las concentraciones de QTC y Mor están en el orden de miligramos por mililitro y se muestran sus correspondientes concentraciones reales de QT en microgramos por mililitro.

Análisis estadístico

Se aplicó un Análisis de Varianza (ANOVA) de una sola vía en el programa SPSS, y se compararon cada uno de los tratamientos con el control y con el testigo de células muertas, así como entre todos los tratamientos por separado. Se consideró como significativo un valor de p < 0.05. Las diferencias en citotoxicidad fueron todas significativas, así como las diferencias en concentración de glucosa extracelular; de modo que estos efectos se deben al tratamiento con quercetina y no al azar. Las diferencias de citotoxicidad y transporte de glucosa fueron más significativas con Mor que con QTS y QTC, mostrando valores de p <0.001 y 0.003, 0.005 y 0.006, comparados con los controles.

DISCUSIÓN

Los compuestos naturales de origen vegetal, se espera que sean benéficos para la salud tan solo por el hecho de ser naturales; sin embargo, como lo afirmó sabiamente el médico renacentista Paracelso: “toda sustancia es un veneno, la dosis puede hacer la diferencia.”¹⁷ Por lo tanto, es de gran importancia evaluar en qué medida los fitoquimicos, provenientes de frutas y verduras, pueden ser benéficos y qué tanto pueden ser tóxicos.

En las últimas décadas la suplementación alimenticia se ha convertido en una estrategia común para mejorar la salud a manera de prevención. Lo que ha incrementado el consumo de los suplementos alimenticios de origen vegetal en presentaciones como las plantas pulverizadas o las fitomoléculas de origen natural como la quercetina. La quercetina se ha utilizado como suplemento alimenticio para promover la salud, con un efecto antidiabético. Se ha reportado en modelos animales que la quercetina promueve la translocación del trasportador de glucosa GLUT4, disminuye el efecto antioxidante promoviendo la protección y regeneración de los islotes pancreáticos, inhibe la amilasa, disminuye la concentración de glucosa, colesterol y triglicéridos en roedores diabéticos, además la peroxidación de lípidos disminuye significativamente en ratas diabéticas. En ensayos clínicos se ha observado,^18,19 que en pacientes con DM2 una dosis de (400 mg) de quercetina inhibió la actividad de la α– glucosidasa y disminuyo la hiperglucemia postprandial. Motivo por el cual, el objetivo del presente estudio fue determinar si la quercetina promueve el transporte de glucosa al interior de la célula, en fibroblastos sanos cultivados in vitro, así como la concentración inhibitoria 50; a fin de extrapolar las concentraciones de quercetina que serían efectivas en el control de la glucosa sin que originen citotoxicidad en el organismo.

Las formas generales de nutracéuticos consisten en productos que complementan la dieta y sustancias herbales en cualquier composición.^20,21 El uso de nutracéuticos en el manejo del autismo puede crear un modelo integrador exitoso con el tratamiento actual para lograr los resultados deseados. (Defeat Autism Now (DAN) Project, 2002).

En el presente estudio, se determinó la concentración de QT con la que sobrevive la mitad de la población de células expuestas a este compuesto, es decir, se estableció la concentración inhibitoria 50 (IC₅₀) de QTS, que fue de 8 µg/mL.

Se encontró variación estadísticamente significativa en la viabilidad y en la concentración de glucosa extracelular. En la gráfica (viabilidad de fibroblastos HA19). Las células tratadas con Mor sobrevivieron más y también transportaron más glucosa al interior de la célula comparado con la QTC, resultados que concuerdan con Balakrishnan BB, 2018, quien reporta el efecto antidiabético de la Moringa. Mor tiene una mezcla de gran cantidad de fitomoléculas que podrían estar interfiriendo con la QT para dar el efecto hipoglucemiante y citoprotector. Además, los azucares unidos a la molécula de QT da origen a una alta concentración de glucósidos de quercetina, probablemente estos azucares unidos a la molécula de QT, le confieren un mayor efecto protector, antioxidante y genoprotector, retrasando la citotoxicidad.^22,24,25

Aunque falta realizar más estudios, con estos primeros resultados se proporciona evidencia de que la QTS es más citotóxica a concentraciones altas, tal como lo reportan diversos autores.^22-24 Sin embargo, en la presentación del extracto acuoso que contiene una alta concentración de glucósidos de quercetina, se observa un efecto citoprotector mucho mayor.

Este efecto citotóxico de la quercetina pura podría deberse a que se forman más especies reactivas ROS y aductos de sus metabolitos o-quinone/quinone a diferencia de Mor, que contiene una alta concentración de glucósidos de quercetina, probablemente los azucares protegen a la QT del metabolismo celular prolongando el efecto antioxidante y genoprotector de la QT.^22,24,25

Es posible que Mor tiene un efecto paradójico, ya que a bajas concentraciones es tóxica y no promueve el transporte de glucosa al interior de las células, pues la glucosa del medio aumenta, casi a la misma magnitud que el testigo de muerte celular por daño oxidativo. Por lo que muy probablemente, promueva este mismo tipo de daño a esas concentraciones.

Parece ser que hay una concentración “ideal” de Mor, de 15 mg/mL (=8.8 µg/mL de QT) en la que se tiene muy baja citotoxicidad y un transporte importante de glucosa al interior de las células.

Las células se expusieron a QTC disuelta con dos procedimientos diferentes, ya que se observó un precipitado inusual cuando se disolvió siguiendo el protocolo recomendado y se decidió modificarlo para obtener una mejor disolución. Esta modificación en la disolución del suplemento, disminuyó su citotoxicidad que, al parecer, se debió al excipiente de dicho suplemento y no a la quercetina. Lo que sugiere que puede ser más conveniente consumir la quercetina de alimentos de origen vegetal y no de suplementos.

En QTS y QTC, va disminuyendo la concentración de QT con respecto al tiempo y ya no se cuantifican a las 24 horas. Mor mantiene su concentración de QT conforme al tiempo, incluso a las 24 horas todavía está presente en el medio; probablemente por la unión a azucares que la protegen de la degradación.

Desde las seis horas de incubación de QT en medio DMEM sin células, ya hay muy poca cantidad, muy probablemente porque se va descomponiendo. Al principio, pensábamos que era porque entraba a las células, pero esto quedó descartado al establecer la cinética de disminución de concentración de QT en medio libre de células.

Por lo tanto, es muy probable que el efecto observado de QT, tanto en viabilidad como en glucosa, se lleve a cabo desde las primeras 3 horas de incubación.

CONCLUSIONES

La QT es un compuesto de origen vegetal que es tóxico de manera proporcional a su concentración en células humanas normales en cultivo. Promueve el transporte de glucosa al interior de las células. La QTC es más citotóxica que la QTS. Mor originó una muerte celular más baja y mayor movilización de glucosa que QTS y QTC.

Este estudio es un primer acercamiento a determinar el efecto y la toxicidad de la quercetina en suplementos alimenticios, en un sistema de cultivo celular. Lo siguiente es determinar la uniformidad de contenido y la estabilidad a distintas condiciones de almacenamiento, así como evaluar su farmacocinética en voluntarios sanos.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la valiosa colaboración de la QFB Christian Alemán López, quien determinó la concentración de glucosa en el medio de cultivo. Asimismo, al Dr. Higinio Arzate, de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Odontología, UNAM, quien amablemente nos donó la línea celular HA19 de fibroblastos humanos.

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